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Jun 16, 2024

Ausscheidungs-/Sekretionsprodukte von erwachsenen Würmern des Typs Trichinella spiralis lindern Myokardinfarkte, indem sie in einem Mausmodell eine M2-Makrophagenpolarisation induzieren

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 362 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Ischämie-induzierte Entzündungsreaktion ist der wichtigste pathologische Mechanismus des Myokardinfarkts

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Die durch Ischämie induzierte Entzündungsreaktion ist der wichtigste pathologische Mechanismus der durch einen Myokardinfarkt (MI) verursachten Schädigung des Herzgewebes. Es ist bekannt, dass Helminthen und aus Würmern stammende Proteine ​​in der Lage sind, die Immunantwort des Wirts zu modulieren, um übermäßige Entzündungen als Überlebensstrategie zu unterdrücken. Es wurde gezeigt, dass Ausscheidungs-/Sekretionsprodukte von erwachsenen Trichinella spiralis-Würmern (Ts-AES) entzündungsbedingte Krankheiten lindern. In dieser Studie wurde Ts-AES zur Behandlung von Mäusen mit MI eingesetzt, um dessen therapeutische Wirkung auf die Reduzierung von MI-induzierten Herzentzündungen und den an der Behandlung beteiligten immunologischen Mechanismus zu bestimmen.

Das MI-Modell wurde durch die Unterbindung der linken vorderen absteigenden Koronararterie und die anschließende Behandlung von Ts-AES durch intraperitoneale Injektion etabliert. Die therapeutische Wirkung von Ts-AES auf MI wurde durch Messung des Herz-Körpergewicht-Verhältnisses, der systolischen und diastolischen Herzfunktionen, der histopathologischen Veränderung im betroffenen Herzgewebe und der Beobachtung der 28-Tage-Überlebensrate bewertet. Die Wirkung von Ts-AES auf die Polarisation von Maus-Makrophagen wurde durch Stimulierung von Maus-Knochenmarks-Makrophagen in vitro mit Ts-AES bestimmt, und der Makrophagen-Phänotyp wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die schützende Wirkung der Ts-AES-regulierten Makrophagenpolarisierung auf hypoxische Kardiomyozyten wurde durch In-vitro-Cokultivierung von Ts-AES-induzierten Maus-Knochenmarkmakrophagen mit hypoxischen Kardiomyozyten und durchflusszytometrisch bestimmter Kardiomyozyten-Apoptose bestimmt.

Wir beobachteten, dass die Behandlung mit Ts-AES die Herzfunktion und den ventrikulären Umbau signifikant verbesserte, pathologische Schäden und Mortalität bei Mäusen mit MI verringerte, mit verringerten proinflammatorischen Zytokinspiegeln, einer erhöhten regulatorischen Zytokinexpression und einer Förderung der Makrophagenpolarisierung vom M1- zum M2-Typ bei MI einherging Mäuse. Die durch Ts-AES induzierte M2-Makrophagenpolarisation reduzierte in vitro auch die Apoptose hypoxischer Kardiomyozyten.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Ts-AES MI bei Mäusen lindert, indem es die Polarisierung von Makrophagen in Richtung des M2-Typs fördert. Ts-AES ist ein potenzieller pharmazeutischer Wirkstoff zur Behandlung von MI und anderen entzündungsbedingten Erkrankungen.

Myokardinfarkt (MI) ist ein Herzinfarkt, der durch eine Unterbrechung oder Blockade des Blutflusses in das Herzgewebe verursacht wird und zu Myokardzellnekrose und Herzversagen führt, mit weltweit hoher Morbidität und Mortalität [1, 2]. Es wird sogar zu einer häufigen Ursache für vorzeitigen Tod in jungen und mittleren Bevölkerungsgruppen [3, 4]. Die mit MI verbundene Mortalität war auch während der COVID-19-Pandemie hoch [5, 6].

Wenn Sie den plötzlichen Tod durch Herzinsuffizienz überlebt haben, umfasst der pathologische Prozess eines MI drei aufeinanderfolgende Phasen: Entzündung, Proliferation und Reifung [7,8,9]. Die Entzündungsphase ist durch die schnelle sterile Entzündung gekennzeichnet [7]. Nach einer Myokardhypoxie-Schädigung setzen nekrotische Zellen Entzündungssignale frei, die Immunwege aktivieren, wie z. B. die Stimulation des Toll-like-Rezeptor-Signalwegs und die Komplementaktivierung, die wiederum eine intensive Entzündungsreaktion auslösen. Ähnlich wie eine mikrobiell induzierte Entzündung rekrutiert auch eine durch MI verursachte sterile Entzündung Neutrophile und Makrophagen, die entzündungsfördernde Zytokine und Chemokine produzieren, insbesondere Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-1 (IL-1) [10]. Die Infiltration von Immunzellen und die Phagozytose tragen dazu bei, beschädigte Zellen und extrazelluläre Matrix zu entfernen [11,12,13], gefolgt von einer proliferativen Phase, die die Umwandlung der proinflammatorischen Reaktion in eine entzündungshemmende Reaktion und die Aktivierung von Fibroblasten in Myofibroblasten, Narbenbildung und Angiogenese umfasst [14]. Die Vermeidung einer Überreaktion der Entzündung und der rechtzeitige Übergang von der Entzündungsphase in die proliferative und reife Phase sind entscheidend für die Prognose eines MI. Eine übermäßige Infiltration von Entzündungszellen und die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen oder reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in das verletzte Herzgewebe könnten die Myokardschädigung verschlimmern und den Myokardumbauprozess verschlechtern [7, 15].

Makrophagen sind einer der am häufigsten im infarktierten Herzen infiltrierten Zelltypen [16] und spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Entzündungsreaktionen und dem anschließenden Heilungsprozess von MI. Beim Auftreten eines Myokardinfarkts dringen viele Blutmonozyten in das ischämische Herzgewebe ein und differenzieren sich zu Makrophagen [17]. Aktivierte Makrophagen können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: klassisch aktivierte Makrophagen (M1-Typ) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2) [18, 19]. In der frühen Pathogenese von MI produzieren M1-Makrophagen mehrere proinflammatorische Zytokine wie IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α und Chemokine, die an der Rekrutierung von Immunzellen und Entzündungsreaktionen beteiligt sind (11, 20). Im mittleren und späten Stadium des Myokardinfarkts werden M1-Makrophagen in M2-Makrophagen umgewandelt, was zum Abklingen der Entzündung und zum Beginn der reparativen/proliferativen Phase führt. M2-Makrophagen sezernieren regulatorische Zytokine wie TGF-β und IL-10, Chemokine (CCL17, CCL22, CCL2) und Arginase-1 (Arg-1), die Entzündungen reduzieren und die Zellproliferation, Angiogenese, extrazelluläre Matrixbildung und Kollagensynthese stimulieren. die die Gewebereparatur erleichtern [16, 21, 22]. Daher ist die Induktion der Makrophagenpolarisierung vom M1- zum M2-Phänotyp und die Modulation des M1- und M2-Gleichgewichts ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Linderung von MI und zur Reduzierung der MI-Mortalität.

In den letzten Jahren hat die „Wurmtherapie“ große Aufmerksamkeit erregt. Würmer und ihre abgeleiteten Proteine ​​haben therapeutische Wirkungen bei einer Vielzahl von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen wie Diabetes [23], Multipler Sklerose [24], allergischer Rhinitis [25], systemischem Lupus erythematodes [26] und Enzephalomyelitis [27] gezeigt. Diese Effekte werden hauptsächlich durch immunmodulierende Immunantworten des Wirts erreicht, um Entzündungsreaktionen zu hemmen und regulatorische Immunantworten einschließlich der Induktion von M2-Makrophagen zu fördern (28, 29). Die Helmintheninfektion oder Folgeprodukte stimulieren die M2-Makrophagenpolarisierung, was übermäßige Entzündungsreaktionen hemmt und die Heilung und Reparatur von Gewebeschäden fördert, die durch mikrobielle Infektionen [30, 31] oder Stoffwechselerkrankungen [32] verursacht werden. Der von Schistosoma japonicum sezernierte Cystein-Protease-Inhibitor (Sj-Cys) linderte wirksam eine durch Sepsis verursachte Myokardschädigung, was darauf hindeutet, dass von Helminthen abgeleitete Proteine ​​die durch die übermäßige Entzündung verursachte Myokardschädigung schützen könnten [33].

Trichinella spiralis ist ein Darmnematode, dessen Larven im Quermuskel leben. Um ihr Überleben in der feindlichen Umgebung des Wirts zu erleichtern, sezernieren die erwachsenen Würmer oder Muskellarven eine Vielzahl von Proteinen, um die Immunantworten des Wirts zu immunmodulieren [34]. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass Extrakte aus erwachsenen T. spiralis-Würmern allergische Entzündungen in einem experimentellen Asthma-Mausmodell reduzierten [35]. Die aus erwachsenen Würmern gewonnenen ES-Produkte verbesserten die DSS-induzierte Kolitis [36]. Interessanterweise könnten beide ES-Produkte, die aus erwachsenen T. spiralis-Würmern oder Muskellarven stammen, Mäuse vor sepsisbedingten Herzschäden (37) und Lungenschäden (31) schützen. In dieser Studie wollten wir feststellen, ob erwachsene ES-Produkte (Ts-AES) von T. spiralis die Fähigkeit besitzen, MI-induzierte sterile Myokardentzündungen/-schäden zu reduzieren und den immunologischen Mechanismus zu verstehen, der mit der therapeutischen Wirkung verbunden ist.

Die spezifisch pathogenfreien männlichen C57BL/6 J-Mäuse (8–10 Wochen alt mit einem Gewicht von 18–22 g), weiblichen ICR-Mäusen (6–8 Wochen alt mit einem Gewicht von 25–30 g) und weiblichen Wistar-Ratten (6 Wochen alt). alt mit einem Gewicht von 180–220 g) wurden vom Experimental Animal Center des Bengbu Medical College gekauft und in einer kontrollierten Umgebung gehalten (12:12 h Licht-/Dunkel-Photozyklus mit einer Temperatur von 22 ± 2 °C und relativer Luftfeuchtigkeit von 55 %). . Alle Tiere erhielten eine normale Ernährung und freien Zugang zu Wasser. Die tierexperimentellen Verfahren entsprechen den tierethischen Standards des Bengbu Medical College und sind von der Ethikkommission genehmigt.

Trichinella spiralis-Muskellarven wurden aus den Muskeln weiblicher ICR-Mäuse isoliert, die 45 Tage lang mit 800 Larven infiziert waren, und zwar mithilfe der Methode der modifizierten Pepsin-Salzsäure-Verdauung [38]. Die gesammelten Muskellarven wurden zur oralen Infektion von Wistar-Ratten (12.000–15.000 Larven pro Ratte) verwendet. Die erwachsenen Würmer wurden 84 Stunden nach der Infektion aus dem Darm entnommen und in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, bei 37 °C und 5 % CO2 48 Stunden lang kultiviert. Der Ts-AES enthaltende Kulturüberstand wurde gesammelt und durch Zentrifugieren mit einem Ultrafiltrationsröhrchen konzentriert und der Puffer in PBS ausgetauscht. Das potenziell kontaminierte Endotoxin in Ts-AES-Produkten wurde mit einem ToxOut™ High Capacity Endotoxin Removal Kit (BioVision, Palo Alto, CA, USA) entfernt und ein niedriger Endotoxinspiegel wurde mit dem ToxinSensor™ Chromogenic Limulus Amöbozytenlysat (LAL) Endotoxin Assay bestätigt Kit (GenScript Biotechnology, Nanjing, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Proteinkonzentration des gesammelten Ts-AES wurde mit dem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit (Beyotime, China) bestimmt und das vorbereitete Ts-AES bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Das MI-Mausmodell wurde durch die Ligation der linken anterioren absteigenden (LAD) Koronararterie wie beschrieben etabliert [39]. Mäuse wurden unter Inhalation von Isofluran betäubt. Auf der linken Brustseite zwischen der 4. und 5. Rippe der Mäuse wurde ein etwa 5 mm langer Einschnitt vorgenommen. Nach dem Öffnen des Perikards wurde die LAD lokalisiert und 3 mm von ihrem Ursprung entfernt mit einer 6–0-Seidennaht abgebunden. Die erfolgreiche Ligation wurde dadurch bestätigt, dass die vordere Wand des linken Ventrikels blass wurde. Die Mäuse in der Scheingruppe wurden einem ähnlichen chirurgischen Eingriff unterzogen, ohne dass LAD ligiert wurde.

Insgesamt 132 C57BL/6 J-Mäuse wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt (33/Gruppe): (i) MI-Mäuse, behandelt mit Ts-AES (MI + AES); (ii) MI-Mäuse, behandelt mit PBS (MI + PBS); (iii) scheinoperierte Mäuse, die mit AES behandelt wurden (Schein + AES); (iv) scheinoperierte Mäuse, behandelt mit PBS (Schein + PBS). Die Mäuse wurden jeweils 30 Minuten nach der Operation intraperitoneal mit 25 µg Ts-AES in einem Gesamtvolumen von 100 µl oder dem gleichen Volumen PBS behandelt und setzten die Behandlung am 2., 4. und 6. Tag nach der Operation fort. Alle Mäuse in jeder Gruppe wurden am 7., 14. und 28. postoperativen Tag einer Echokardiographie unterzogen, um die Herzfunktion zu untersuchen. Sechs Mäuse aus jeder Gruppe wurden nach jedem Echokardiogramm getötet und das Augenblut und die Herzen wurden gesammelt. Die Seren wurden getrennt und bei –20 °C gelagert. Jedes Herz wurde gewogen und das Herz-Körpergewicht-Verhältnis berechnet. Die Überlebensrate der verbleibenden Mäuse in jeder Gruppe (15 Mäuse) wurde 28 Tage lang beobachtet.

Die Spiegel von IL-6, TNF-α, TGF-β und IL-10 in Seren von Mäusen wurden mit dem LEGEND MAX™ ELISA-Kit (Dakewe Biotech, China) gemessen.

Die Echokardiographie wurde an Mäusen unter Verwendung eines visuellen Ultraschallbildgebungssystems für Tiere mit Maussonden (VisualSonics, Kanada und MS-400-Sonde) wie zuvor beschrieben durchgeführt (40). Jede Maus wurde in Rückenlage an einem Thermostat befestigt und an den Gliedmaßen waren Elektroden angebracht. Die oberflächliche Anästhesie wurde mit 1 % Isofluran und Sauerstoff aufrechterhalten. Der Langachsen-B-Modus wurde verwendet, um Bilder des linken Ventrikels zu erfassen, und M-Bewegungskurven der linken Ventrikelwand wurden für mindestens drei kontinuierliche und stabile Herzzyklen erfasst. Mithilfe der linksventrikulären Trace-Methode wurden die folgenden Parameter ermittelt: Schlagvolumen (SV), linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF), linksventrikuläre fraktionierte Verkürzung (LVFS), linksventrikuläres endsystolisches Volumen (LVESV) und linksventrikuläres enddiastolisches Volumen (LVEDV). ). Alle Daten wurden aus drei Herzzyklen gemittelt. Die Positionen der Mitralklappenöffnung und des Ventrikelseptums wurden mit M-Mode-Ultraschall beurteilt, das Flussspektrum der Mitralklappenöffnung wurde mit dem Pulsspektrum-Doppler beobachtet und das Myokardbewegungsspektrogramm des Mitralanulus des Ventrikelseptums wurde mit dem Gewebe-Doppler-Modul erfasst . Die folgenden Parameter wie der Spitzenwert des frühdiastolischen Blutflusses (E-Peak), der Spitzenwert des spätdiastolischen Blutflusses (A-Peak), die isovolumische Kontraktionszeit (IVCT), die isovolumische Relaxationszeit (IVRT) und die Auswurfzeit (ET) wurden gemessen, um E/A-Werte und den linksventrikulären Myokardleistungsindex (LV MPI) in drei Herzzyklen zu erhalten [41]. Alle Operationen wurden von derselben Person durchgeführt und die Herzfrequenz der Maus wurde konstant gehalten, wenn Bilder im Zustimmungsmodus aufgenommen wurden, um Manipulationsfehler und den Einfluss der Herzfrequenz auf experimentelle Ergebnisse auszuschließen.

Die von jeder Mäusegruppe zu unterschiedlichen Zeitpunkten (7, 14, 28 Tage nach der Operation) gesammelten Herzen wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffinblöcke eingebettet. Das Myokardgewebe wurde in 5 μm dicke Abschnitte geschnitten. Die H&E-Färbung (Servicebio, China) oder die Masson-Trichrom-Färbung (Servicebio, China) wurde wie beschrieben an Schnitten durchgeführt [42]. Die histopathologischen Veränderungen und das Ausmaß der Fibrose wurden unter einem Mikroskop (Nikon, Japan) beobachtet.

Die Gesamt-RNA wurde aus Herzinfarktzonen oder derselben Lokalisierungsregion in Gruppen von Sham + AES und Sham + PBS unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (TransGen Biotech, China) extrahiert und durch OD260 quantifiziert. Die Gesamt-cDNAs wurden aus 2 µg Gesamt-RNA unter Verwendung des Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (TransGen Biotech, China) revers transkribiert. Die relative mRNA-Expression verschiedener Zytokine (IL-6, TNF-α, IL-10 und TGF-β), Makrophagenpolarisations-bezogener Marker (iNOS und CD206), Myofibroblastenmarker (α-SMA) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF). ) im Herzgewebe wurde mit PerfectStart®Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China) auf dem Echtzeit-PCR-System Roche LightCycler® 96 (Roche Molecular Systems, USA) unter Verwendung der entsprechenden in Tabelle 1 aufgeführten Primer bestimmt. Die relative mRNA-Expression wurde berechnet durch die Formel 2−△△Ct im Vergleich zum Housekeeping-GAPGH.

Die Oberschenkel- und Schienbeinknochen wurden von getöteten C57BL/6J-Mäusen abgetrennt und die Knochenmarkszellen wurden durch Spülen der Knochenmarkshöhlen mit vollständigem DMEM-Medium (Gibco, USA), das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt (Every Green, China), extrahiert ) und Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 µg/ml) (Beyotime Biotechnology, China). Die Zellsuspension wurde durch ein 200-Mesh-Sieb filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen, und zweimal gewaschen. Die gesammelten Knochenmarkszellen wurden in einem vollständigen DMEM-Medium, das 20 ng/ml murinen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) (R&D Systems, USA) enthielt, 7 Tage lang kultiviert. Die auf den Platten anhaftenden Zellen wurden als reife BMDMs gesammelt.

Die oben erhaltenen gereiften BMDMs wurden in vier Gruppen mit 1 × 106 Zellen für jede Gruppe eingeteilt: (i) BMDMs, inkubiert mit Ts-AES (4 μg/ml) (AES + Mφ); (ii) BMDMs, inkubiert mit LPS (100 ng/ml) (Solarbio, China) und IFN-γ (10 ng/ml) (R&D Systems, USA) (LPS + IFN-γ + Mφ); (iii) BMDMs, inkubiert mit LPS (100 ng/ml) und IFN-γ (10 ng/ml) in Gegenwart von Ts-AES (4 μg/ml) (AES + LPS + IFN-γ + Mφ); (iv) BMDMs, inkubiert mit PBS als Kontrollgruppe (PBS + Mφ). Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen gesammelt und der M1-Makrophagen-assoziierte Marker CD86 und der M2-Makrophagen-assoziierte Marker CD206, die auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wurden, durch Durchflusszytometrie gemessen.

Um die lebenden von den toten Zellen zu unterscheiden, wurden kultivierte BMDM-Zellen 10 Minuten lang mit dem fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff Efluor 510 (BioLegend, USA) behandelt. Nach 10-minütiger Blockierung mit Fc-Rezeptorblocker (BioLegend, USA) wurden die Zellen mit FITC-anti-F4/80 (BioLegend, USA), BV605-anti-CD11b (BioLegend, USA) und APC-anti-CD86 inkubiert (Thermo Fisher Scientific, USA) Antikörper für 25 Minuten. Um CD206 anzufärben, wurden die Zellen mit einem Thermo Fixation/Permeabilization Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) fixiert und permeabilisiert und 30 Minuten lang mit PE-anti-CD206 (BioLegend, USA) gefärbt.

Das Verhältnis apoptotischer hypoxischer Kardiomyozytenzellen wurde unter Verwendung von Annexin V-AbFluor™/PI (Bestbio, China) bestimmt. Die Zellen wurden geerntet und in Bindungspuffer suspendiert und dann 15 Minuten lang mit Annexin V und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und unter dunklen Bedingungen mit PI gefärbt. Die Durchflusszytometrie für diese gefärbten Zellen wurde mit einem DxP Athena™-Durchflusszytometer (Cytek Biosciences, USA) durchgeführt. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software v10.5 (FlowJo LLC) berechnet.

Die primären Maus-Kardiomyozyten wurden wie beschrieben gewonnen [43]. Kurz gesagt, die Herzen wurden aseptisch von getöteten C57BL/6-Mäusen (1–3 Tage alt) gesammelt, in Stücke geschnitten und dann in D-HankS-Lösung (Gibco, USA) verdaut, die Trypsin (Gibco, USA), Kollagenase (Solarbio, USA) enthielt. China) und DNase I (Solarbio, China) [43] bei 37 °C für 10 Minuten. Der Aufschluss wurde fünfmal durchgeführt, bis einzelne Herzzellen erhalten wurden. Die einzelnen Herzzellen wurden in DMEM-F12 (Gibco, USA) mit 10 % FBS (Every Green, China) bei 37 °C und 5 % CO2 2 Stunden lang kultiviert. Die anhaftenden Zellen (hauptsächlich die Fibroblasten) wurden entfernt und die suspendierten Zellen wurden 48 Stunden lang in 4 ml DMEM-F12-Komplettmedium mit 0,1 mmol/l 5-Brom-2-desoxyuridin (Sigma-Aldrich, Deutschland) kultiviert, um Fibroblasten zu hemmen Wachstum. Die Zellen wurden weitere 24–48 Stunden in Vollmedium ohne 5-Brom-2-desoxyuridin kultiviert, um primäre Kardiomyozyten zu erhalten.

Die oben erhaltenen primären Kardiomyozyten wurden in Platten mit sechs Vertiefungen mit 1 × 106/Vertiefung in DMEM-Medium mit niedrigem Glucosegehalt ohne FBS ausgesät. Die aus dem Knochenmark stammenden reifen Makrophagenzellen (BMDMs) wurden in Medium mit Ts-AES (4 μg/ml) oder LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 ng/ml) vorbehandelt, gewaschen und ausgesät Die Bodenfläche der Transwell-Kammern mit einer Porengröße von 0,4 μm (Corning, USA) wurde mit 2 × 105/Well injiziert und dann in die mit primären Kardiomyozyten besiedelte Sechs-Well-Platte eingesetzt [44]. Die Kulturumgebung wurde in einem mit anaerobem Gas (Mitsubishi Gas Chemical, Japan) gefüllten Kulturbeutel mit einem Sauerstoffgehalt-Indikatorstreifen (Mitsubishi Gas Chemical, Japan) auf anaerobe Bedingungen eingestellt [45]. Der Sauerstoffgehalt im Beutel sollte < 1 % betragen. Nach 24-stündiger Inkubation unter anaeroben Bedingungen wurden die Zellen gesammelt, um die Apoptose der Kardiomyozyten mittels Durchflusszytometrie zu messen. Die Kulturüberstände wurden gesammelt, um die Konzentration von IL-6, TNF-α, TGF-β und IL-10 unter Verwendung von LEGEND MAX™ELISA-Kits (Dakewe Biotech, China) zu messen.

Die Software GraphPad Prism Version 7 (GraphPad Software, Inc., USA) wurde verwendet, um statistische Unterschiede zwischen Gruppen zu analysieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Normalitätstests und der einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichstest oder einem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test. Der Unterschied in den Überlebensraten zwischen den Gruppen wurde mithilfe des Chi-Quadrat-Tests verglichen. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Das MI-Mausmodell wurde durch Ligatur der linken anterioren absteigenden Koronararterie (LAD) etabliert. Um die therapeutische Wirkung von Ts-AES auf Mäuse mit MI zu bewerten, wurden die Mäuse mit MI-Operation intraperitoneal mit 25 µg Ts-AES für jede Maus behandelt. Die 28-Tage-Überlebensrate der mit Ts-AES behandelten Gruppe (MI + AES) erreichte 93,3 % (14/15), was deutlich höher ist als die 60 % (9/15) Überlebensrate der MI-Gruppe ohne Behandlung (MI +). PBS) (Chi-Quadrat-Test, χ2 = 4,714, df = 1, P = 0,0299) (Abb. 1a). Die meisten Todesfälle ereigneten sich innerhalb der ersten Woche nach der MI-Operation. Alle Mäuse in scheinoperierten Mäusen, die entweder mit Ts-AES (Schein + AES) oder PBS (Schein + PBS) behandelt wurden, überlebten bis zu 28 Tage. Auch das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht war in der mit Ts-AES behandelten MI-Gruppe im Vergleich zu denen ohne Behandlung 7, 14 und 28 Tage nach der MI-Operation signifikant verringert, mit dem signifikantesten Unterschied 28 Tage (7d: ANOVA, F(3, 20) = 19,26, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 22,07, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 54,73, P < 0,0001) (Abb. 1b). Die Beobachtung der groben Pathologie an Herzen, die 28 Tage nach der Behandlung gesammelt wurden, ergab, dass die Infarktzone in den Herzen von unbehandelten MI-Mäusen (MI + PBS) deutlich sichtbar war, während die Infarktzone bei mit Ts-AES behandelten Mäusen (MI + AES) heller und kleiner war ) (Abb. 1c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Behandlung mit Ts-AES den Myokardinfarkt erheblich lindert, indem sie die Überlebensrate auf bis zu 28 Tage verbessert und die grobe Pathologie in den betroffenen Herzen reduziert.

Ts-AES lindert MI erheblich, indem es die Überlebensrate auf bis zu 28 Tage verbessert und das Verhältnis von Herz- zu Körpergewicht verringert. Ein Ts-AES erhöhte die Überlebensrate von Mäusen mit MI signifikant um bis zu 28 Tage (93,3 %) im Vergleich zu Mäusen, die PBS erhielten (60 %) im gleichen Beobachtungszeitraum (n = 15). b Ts-AES reduzierte das Herz-Körpergewicht-Verhältnis von Mäusen mit MI (n = 6). c Die repräsentativen Herzbilder verschiedener Behandlungsgruppen unter Asana-Mikroskopie. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dargestellt

Bei jeder Maus jeder Gruppe wurden am 7., 14. und 28. postoperativen Tag Echokardiogramme durchgeführt. Das Echokardiogramm im Langachsen-B-Modus zeigte, dass unbehandelte MI-Mäuse (MI + PBS) deutlich größere Herzkammern aufwiesen, die birnen- oder kugelförmig waren, und die vordere und hintere Wandbewegung des linken Ventrikels war deutlich reduziert, während die MI-Mäuse deutlich reduziert waren Die mit Ts-AES (MI + AES) behandelten Patienten hatten kleinere Herzkammern und eine deutlich verbesserte Wandbewegung (Abb. 2a). Pulsspektrum-Doppler (Abb. 2b) und Gewebe-Doppler (Abb. 2c) zeigten auch, dass der E-Peak bei Mäusen mit MI am 14. und 28. Tag nach der Operation in den A-Peak umgekehrt wurde. Die Behandlung mit Ts-AES reduzierte die E/A-Peak-Inversion. Die beeinträchtigten linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktionen wurden auch bei Mäusen mit MI beobachtet, die verringerte LVEF, LVFS, SV und E/A und erhöhte LVEDV, LVESV und LV MPI zeigten (7d: ANOVA, F(3, 20) = 277,1, P < 0,0001; F(3, 20) = 32,91, P < 0,0001; F(3, 20) = 24,28, P < 0,0001; F(3, 20) = 10,51, P = 0,0002; F(3, 20) = 30,04, P < 0,0001; F(3, 20) = 183,6, P < 0,0001; F(3, 20) = 37,03, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 379,9, P < 0,0001; F(3 , 20) = 101,6, P < 0,0001; F(3, 20) = 32,75, P < 0,0001; F(3, 20) = 21,87, P < 0,0001; F(3, 20) = 36,37, P < 0,0001; F (3, 20) = 124,2, P < 0,0001; F(3, 20) = 29,95, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 331,3, P < 0,0001; F(3, 20) = 74,75 , P < 0,0001; F(3, 20) = 29,93, P < 0,0001; F(3, 20) = 30,79, P < 0,0001; F(3, 20) = 48,93, P < 0,0001; F(3, 20) = 137,4, P < 0,0001; F(3, 20) = 25,35, P < 0,0001). Die Behandlung mit Ts-AES verbesserte die LV-Funktionen signifikant, gemessen am 7., 14. und 28. postoperativen Tag, gemessen anhand dieser Parameter (Abb. 2d – j). Bei Mäusen mit Scheinoperation, die entweder mit Ts-AES (Schein + AES) oder PBS (Schein + PBS) behandelt wurden, wurde keine systolische oder diastolische Funktionsänderung beobachtet. Die Herzfrequenz der Mäuse wurde zum Zeitpunkt der echokardiographischen Erfassung im Einwilligungsmodus konstant gehalten, ohne signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen, um sicherzustellen, dass die Herzfunktion der Mäuse nicht durch eine Änderung der Herzfrequenz beeinträchtigt wurde (7d: ANOVA, F(3). , 20) = 0,2427, P = 0,8655; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 0,4449, P = 0,7235; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 0,1775, P = 0,9104) (Abb. 2k). Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ts-AES die Herzfunktionsstörung von Mäusen mit MI signifikant verbessert.

Herzfunktionsveränderungen in verschiedenen Gruppen von Mäusen, gemessen durch Herzechokardiogramm 7 Tage, 14 Tage und 28 Tage nach der MI-Operation, was zeigt, dass Ts-AES die systolische und diastolische Herzfunktion bei Mäusen mit MI signifikant verbesserte. a–c Repräsentative echokardiographische Veränderungen im Längsachsen-B-Modus, Pulsspektrum-Doppler und Gewebe-Doppler in jeder Mäusegruppe. d–J Veränderungen der systolischen und diastolischen Funktionen (LVEF, LVFS, SV, MV E/A; LV MPI IV, LVEDV, LVESV) bei Mäusen mit MI. k Herzfrequenz der Mäuse in jeder Gruppe, als die Bilder aufgenommen wurden. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM (n = 6), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dargestellt

Der Grad der Myokardschädigung und der Infiltration entzündlicher Zellen im Grenzflächenbereich des MI bei Mäusen wurde durch histochemische Untersuchung mit H&E-Färbung beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Mäusen mit MI-Operation (MI + PBS) viele Entzündungszellen signifikant in den Schnittstellenbereich des MI infiltriert waren. Viele Myokardzellen waren vakuolisiert und die Myokardfasern waren gebrochen. Bei Mäusen, die mit Ts-AES (MI + AES) behandelt wurden, waren die Infiltration von Entzündungszellen und die Schädigung von Myokardzellen im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung deutlich reduziert. In den Scheinoperationsgruppen mit oder ohne Behandlung von Ts-AES wurden keine pathologischen Veränderungen beobachtet (Abb. 3). Die histopathologischen Ergebnisse zeigten, dass Ts-AES in der Lage war, MI-verursachte Myokardschäden zu lindern, indem es die Infiltration entzündlicher Zellen bei MI-Mäusen verringerte und abgestorbene Myokardzellen reduzierte.

Ts-AES linderte Myokardschäden bei Mäusen mit MI. Repräsentative Abschnitte der H&E-Färbung des MI-Verbindungsbereichs in jeder Gruppe (200 ×, Maßstabsbalken: 100 μm)

Die histopathologische Untersuchung des betroffenen Herzgewebes ergab die therapeutische Wirkung von Ts-AES auf die Heilung von durch MI verursachten Herzschäden, die durch eine verringerte Fibrosefärbung mit Masson und eine verringerte Zerstörung des Herzgewebes (Abb. 4a) sowie eine deutlich erhöhte Wanddicke des LV-Infarkts gekennzeichnet sind Fläche (7d: t-Test, t(6) = 6,463, P = 0,0007; 14d: t-Test, t(6) = 5,792, P = 0,0012; 28d: t-Test, t(6) = 6,086, P = 0,0009) (Abb. 4b) und reduzierte LV-Infarktfläche am 7., 14. und 28. Tag nach der MI-Operation (7d: t-Test, t(6) = 3,957, P = 0,0075; 14d: t-Test, t( 6) = 5,266, P = 0,0019; 28d: t-Test, t(6) = 4,870, P = 0,0028) (Abb. 4c) im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung von Ts-AES (MI + PBS). Die Masson-Färbung ergab, dass es am 7. Tag keine sichtbare Veränderung der Größe der Fibrose gab, sie war jedoch in der mit Ts-AES behandelten Gruppe an den Tagen 14 und 28 im Vergleich zur PBS-Kontrolle signifikant verringert (7d: t-Test, t( 6) = 1,045, P = 0,3364; 14d: t-Test, t(6) = 4,209, P = 0,0056; 28d: t-Test, t(6) = 5,814, P = 0,0011) (Abb. 4d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ts-AES übermäßige Fibrose reduziert und den ventrikulären Umbau nach einem Herzinfarkt erleichtert.

Ts-AES hemmte übermäßige Myokardfibrose und förderte den ventrikulären Umbau nach MI bei Mäusen. a Repräsentative Abschnitte der Masson-Färbung von infarziertem Herzgewebe in jeder Gruppe nach MI (400 ×, Maßstabsbalken: 50 μm). b Dicke der linken Ventrikelwand in jeder Gruppe (n = 4). c Prozentualer Infarktbereich des LV in jeder Gruppe (n = 4). d Fibrosebereich der Infarktzone (IZ) in jeder Gruppe (n = 4). e mRNA-Transkriptionsniveaus von α-SMA in der Infarktzone (n = 6). f mRNA-Transkriptionsniveaus von VEGF in der Infarktregion des Herzens in jeder behandelten Gruppe (n = 6). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dargestellt

Nach einem Myofibroblasten ist das von Myofibroblasten sezernierte α-SMA an der Fibrose des infarktierten Herzgewebes beteiligt, und VEGF ist an der Revaskularisierung beteiligt, um die Reparatur des infarktierten Myokards zu erleichtern. Um zu untersuchen, ob Ts-AES myokardiale Hyperfibrose lindert und die Revaskularisierung nach MI fördert, wurde die mRNA-Expression von α-SMA und VEGF im Infarktbereich von MI-Mäusen durch RT-qPCR nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die α-SMA-Transkriptionsexpression im infarzierten Herzgewebe nach der MI-Operation erhöht war und am 14. Tag den höchsten Wert erreichte. Nach der Behandlung mit Ts-AES war das α-SMA-Transkriptionsexpressionsniveau jedoch am Tag deutlich verringert 14 nach MI-Operation (MI + AES) im Vergleich zur Gruppe ohne Behandlung (MI + PBS) (7d: ANOVA, F(3, 20) = 3,147, P = 0,0478; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 101,0, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 6,653, P = 0,0027) (Abb. 4e). Im Gegensatz dazu war die Transkriptionsexpression von VEGF kurz nach der Behandlung mit Ts-AES signifikant erhöht und blieb bis zu 28 Tage nach dem MI auf dem hohen Niveau, selbst in beiden MI- oder Scheinoperationsgruppen mit Ts-AES-Behandlung (7d: ANOVA, F (3, 20) = 40,07, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 38,10, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 73,54, P < 0,0001) (Abb. 4f ). Die Ergebnisse legen nahe, dass Ts-AES zu einer verringerten Myokardfibrose und einer erhöhten Revaskularisierung im infarktierten Herzgewebe beitragen kann.

Um festzustellen, ob entzündliche Zytokine am Entwicklungsverlauf und der Prognose eines MI beteiligt sind, wurden die Spiegel der entzündlichen Zytokine IL-6 und TNF-α in Seren von Mäusen mit MI-Operation gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die serologischen Werte von IL-6 und TNF-α bei Mäusen 7 Tage nach der MI-Operation signifikant erhöht waren und die hohen Werte bis zu 28 Tage nach Auftreten des MI anhielten. Allerdings waren diese proinflammatorischen Zytokine nach der Behandlung mit Ts-AES im Vergleich zu denen ohne Behandlung signifikant verringert (7d: ANOVA, F(3, 20) = 25,79, P < 0,0001; F(3, 20) = 329,5, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 74,64, P < 0,0001; F(3, 20) = 154,8, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 17,58, P < 0,0001; F(3, 20) = 40,57 bzw. P < 0,0001) (Abb. 5a, b). Bei Mäusen mit Scheinoperation mit oder ohne Ts-AES gab es keine Veränderung dieser entzündlichen Zytokine. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ts-AES spezifisch MI-induzierte Entzündungen reduziert. Andererseits erhöhte die Behandlung mit Ts-AES die IL-10-Spiegel in Seren von Mäusen mit MI-Operation signifikant und erreichte den Höhepunkt 14 Tage nach der Operation (7d: ANOVA, F(3, 20) = 20,21, P < 0,0001 ; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 101,2, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 65,12, P < 0,0001) (Abb. 5c). Der TGF-β-Spiegel war auch in den Seren von Mäusen im Frühstadium des MI (7 Tage nach der MI-Operation) erhöht, im Spätstadium des MI wurde jedoch kein Anstieg oder gar Abfall beobachtet (7d: ANOVA, F(3). , 20) = 10,63, P = 0,0002; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 7,930, P = 0,0011; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 66,11, P < 0,0001) (Abb. 5d).

Ts-AES reduzierte systemisch die proinflammatorischen Zytokinspiegel (IL-6, TNF-α) und erhöhte IL-10 und TGF-β in Seren von Mäusen mit MI (n = 6). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dargestellt

Ähnliche Wirkungen der Ts-AES-Behandlung auf diese Zytokine wurden auch im Herzgewebe durch Messung ihrer mRNA-Spiegel festgestellt. Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Expressionsniveaus der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α im Herzgewebe von Mäusen mit MI, die mit Ts-AES behandelt wurden (MI + AES), im Vergleich zu Mäusen ohne Behandlung signifikant reduziert waren ( MI + PBS) (7d: ANOVA, F(3, 20) = 175,5, P < 0,0001; F(3, 20) = 48,80, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 103,9, P < 0,0001; F(3, 20) = 64,24, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 59,64, P < 0,0001; F(3, 20) = 25,72, P < 0,0001) (Abb. 6a, b). In ähnlicher Weise zeigten die mRNA-Expressionsniveaus von IL-10 und TGF-β im Herzgewebe von mit AES (MI + AES) behandelten MI-Mäusen das gleiche Änderungsmuster wie in Seren (Abb. 6c, d), mit konstant erhöhtem IL-10 während der MI-Kurs (7d: ANOVA, F(3, 20) = 88,39, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 97,92, P < 0,0001; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 51,56, P < 0,0001) und relativ erhöhtes TGF-β im Frühstadium der MI-Operation (7d: ANOVA, F(3, 20) = 20,39, P < 0,0001). Die Ergebnisse legen nahe, dass die Behandlung mit Ts-AES systemisch oder in situ die proinflammatorische Zytokinexpression (TNF-α und IL-6) hemmt, aber die Expression regulatorischer Zytokine (hauptsächlich IL-10) stimuliert, nachdem ein Myokardinfarkt aufgetreten ist, was im Einklang steht mit verringerte pathologische Schädigung des infarktierten Herzgewebes und verbesserte Heilung des Herzgewebes.

Ts-AES regulierte die mRNA-Expression entzündungsfördernder oder entzündungshemmender Zytokine in der Infarktregion von Mäusen mit MI und förderte die Polarisation von Makrophagen zum M2-Typ (n = 6). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dargestellt

Um festzustellen, ob Makrophagen und ihre Phänotypen an der Entzündungsreaktion oder Gewebereparatur im Herzinfarkt beteiligt sind, wurden die mRNA-Expressionsniveaus des M1-Makrophagenmarkers iNOS und des M2-Makrophagenmarkers CD206 im Herzinfarktgewebe mit RT-qPCR gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die mRNA-Expressionsniveaus von iNOS in der MI-Zone im Frühstadium des MI (Tag 7 und Tag 14) im Vergleich zu Mäusen mit Scheinoperation stark stimuliert waren, am 28. Tag jedoch wieder auf den Normalwert zurückkehrten. Es gab keine signifikante Veränderung in der MI-Zone mRNA-Expression von CD206 im MI-Herzgewebe im Vergleich zu der in der Scheinoperationsgruppe. Allerdings reduzierte die Behandlung mit Ts-AES die mRNA-Expression von iNOS signifikant und erhöhte die mRNA-Expression von CD206 im Herzgewebe von Mäusen mit MI (MI + AES) im Vergleich zu MI-Mäusen ohne Behandlung (MI + PBS). Bemerkenswerterweise wurde die CD206-mRNA auch bei der Behandlung von Ts-AES selbst in der Gruppe mit Scheinoperationen hochreguliert, was darauf hindeutet, dass Ts-AES ein starker Treiber für M2-Makrophagen ist (7d: ANOVA, F(3, 20) = 68,98, P < 0,0001; F (3, 20) = 38,35, P < 0,0001; 14d: ANOVA, F(3, 20) = 63,67, P < 0,0001; F(3, 20) = 10,68, P = 0,0002; 28d: ANOVA, F(3, 20) = 5,252, P = 0,0078; F(3, 20) = 14,40, P < 0,0001) (Abb. 6e, f). Die Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Ts-AES das Immunsystem des Wirts immunmoduliert, um die Makrophagenpolarisierung vom M1- zum M2-Phänotyp voranzutreiben, was mit den oben gemessenen verringerten proinflammatorischen Zytokinen und erhöhten regulatorischen Zytokinen im Herzgewebe und folglich mit der verringerten Herzpathologie korreliert verstärkte Umgestaltung der Herzstruktur und -funktion nach einem MI.

Um die Rolle von Ts-AES bei der Makrophagenpolarisierung zu untersuchen, wurden die BMDMs 24 Stunden lang mit Ts-AES inkubiert und die Veränderungen der Zellmarker auf BMDMs durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass Ts-AES die F4/80+CD11b+CD86+ (M1)-Makrophagen (AES + Mφ) im Vergleich zur Gruppe mit PBS (PBS + Mφ) signifikant reduzierte. Als Positivkontrolle stimulierte LPS + IFN-γ stark F4/80+CD11b+CD86+-Makrophagen (M1) (ANOVA, F(3, 20) = 215,6, P < 0,0001) (Abb. 7b). Es wurde auch festgestellt, dass Ts-AES selbst nur geringe Auswirkungen auf M2-Makrophagen (F4/80+CD11b+CD206+) hatte; Allerdings stimulierte Ts-AES die M2-Makrophagenpolarisation in einer entzündlichen Umgebung (unter Stimulation von LPS + IFN-γ) stark (ANOVA, F(3, 20) = 20,32, P <0,0001) (Abb. 7c) und ahmte die induzierte entzündliche Umgebung nach von MI in diesem Modell.

Ts-AES induzierte in vitro die M2-Makrophagenpolarisation. An reifen BMDMs wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um CD11b+F4/80+-Makrophagen mithilfe von FACS zu sortieren. BMDMs wurden mit Ts-AES (4 µg/ml), LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 ng/ml), Ts-AES (4 µg/ml) + LPS (100 ng/ml) + inkubiert IFN-γ (10 ng/ml) bzw. PBS für 24 Stunden. Die Marker M1 (CD86) und M2 (CD206) wurden durch FACS erkannt. b Prozentsatz von CD86 (M1) in Makrophagen, die mit verschiedenen Stimulatoren inkubiert wurden. c Prozentsatz von CD206 (M2) in verschiedenen Inkubationsgruppen. d M1/M2-Verhältnis in verschiedenen Gruppen. e M2/M1-Verhältnis in verschiedenen Gruppen (n = 6). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Um die Schutzwirkung von Ts-AES-behandelten Makrophagen auf hypoxische Kardiomyozyten (Mc) in vitro weiter zu bestimmen, untersuchten wir die Spiegel von entzündlichen Zytokinen (IL-6, TNF-α) und regulatorischen Zytokinen (IL-10 und TGF-β). in den Kulturüberständen und der Prozentsatz apoptotischer Kardiomyozyten nach der Co-Kultivierung unter Hypoxiebedingungen. Nach der Inkubation mit Ts-AES-behandelten BMDMs (Mc + AES-BMDMs) waren die IL-6- und TNF-α-Spiegel im Kulturüberstand signifikant verringert (ANOVA, F(2, 15) = 154,0, P < 0,0001). ; F(2, 15) = 194,2 bzw. P < 0,0001) (Abb. 8a, b), während die Spiegel des regulatorischen Zytokins IL-10 und TGF-β signifikant anstiegen (ANOVA, F(2, 15) = 52,59, P < 0,0001; F(2, 15) = 76,58, P < 0,0001) (Abb. 8c, d). Unterdessen war der Prozentsatz der Apoptose in hypoxischen Kardiomyozyten bei Co-Kultivierung mit Ts-AES (Mc + AES-BMDMs) im Vergleich zur Kultur ohne Ts-AES (Mc + PBS-BMDMs) bei Co-Kultivierung mit LPS + IFN signifikant verringert -γ erhöhte die Apoptose hypoxischer Kardiomyozyten (Mc + LPS/IFN-γ-BMDMs) signifikant (ANOVA, F(2, 9) = 53,61, P <0,0001) (Abb. 8e, f). Die Ergebnisse legen nahe, dass die mit Ts-AES behandelten BMDMs die hypoxische Kardiomyozyten-Apoptose in vitro reduzieren, möglicherweise durch Stimulierung von M2-Makrophagen, um entzündliche Zytokine zu reduzieren und regulatorische Zytokine zu steigern, die Kardiomyozyten vor Schäden durch Anoxie schützen.

Mit Ts-AES behandelte BMDMs reduzierten die Hypoxie-induzierte Kardiomyozyten-Apoptose in vitro. Die Transwell-Technologie wurde verwendet, um die primären Kardiomyozyten gemeinsam mit mit Ts-AES (4 µg/ml) behandelten BMDMs, mit LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 ng/ml) behandelten BMDMs oder unbehandelten BMDMs zu kultivieren in einer hypoxischen Umgebung für 24 Stunden. Mithilfe von ELISA wurden die Spiegel an entzündlichen Zytokinen (IL-6, TNF-α) und regulatorischen Zytokinen (IL-10 und TGF-β) im Kulturüberstand (n = 6) gemessen, und Durchflusszytometrie wurde zum Nachweis der Apoptose eingesetzt Rate der Kardiomyozyten in jeder Kulturgruppe (n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Die durch Ischämie und Hypoxie verursachte Entzündungsreaktion ist der wichtigste pathologische Mechanismus der durch MI verursachten Myokardschädigung. Es bestimmt den Schweregrad des Myokardinfarkts und den darauffolgenden ventrikulären Umbau. Die bei den sterilen Entzündungsreaktionen vermittelten Immunzellen spielen eine doppelte Rolle bei der Verletzung und dem Schutz bei Herzhypoxie und -reparatur (46, 47). Es ist von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht der entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Signalwege im Verlauf eines Myokardinfarkts aufrechtzuerhalten, um entzündungsbedingte Herzgewebeschäden zu reduzieren und die Reparatur und den Umbau der Herz-Kreislauf-Struktur zu fördern [17]. In dieser Studie haben wir versucht, Ts-AES als alternativen Behandlungsansatz für MI zu nutzen, basierend auf ihren zuvor identifizierten starken immunmodulatorischen und regulatorischen Funktionen [48]. Die Behandlung mit Ts-AES reduzierte die Mortalität von Herzinfarkten deutlich, verbesserte die Herzfunktionen und den Strukturumbau und linderte Entzündungsreaktionen und Organschäden im infarzierten Herzgewebe. Die vielversprechenden Ergebnisse bieten einen neuartigen Ansatz für den Einsatz von aus Helminthen stammenden immunmodulatorischen Proteinen bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen oder Gewebeverletzungen wie Myokardinfarkt.

Atherosklerose, die zu Thromboembolien führt, gilt als häufigste Ursache für Herzinfarkt [49]. Um ein Mausmodell für MI zu erstellen, haben wir LAD ligiert, um den myokardialen Blutfluss zu blockieren und so die Pathologie von MI im klinischen Bereich erfolgreich nachzuahmen. In dieser Studie haben wir ein MI-Mausmodell erstellt und MI-induzierte Herzschäden bei Mäusen beobachtet, hauptsächlich in Form von strukturellen und funktionellen Schäden, begleitet von erhöhten Konzentrationen proinflammatorischer Faktoren in Blut und Gewebe, was den pathophysiologischen Merkmalen von sehr ähnlich ist MI wurde bei klinischen Patienten beobachtet.

Wie bereits beschrieben, durchlaufen Makrophagen nach einem Myokardinfarkt einen Übergang von einer frühen proinflammatorischen zu einer späten entzündungshemmenden Wirkung [16]. Allerdings kann eine längere proinflammatorische Reaktion nach einem Myokardinfarkt zu schwerwiegenden pathologischen Folgen führen, darunter Absterben von Kardiomyozyten, Beeinträchtigung der systolischen Funktion, Vorhofdilatation aufgrund umfassender Matrixdegradation, Beeinträchtigung der Integrität der Ventrikelwand, Herzruptur und Fibrose [11, 50]. M1-Makrophagen-sekretiertes TNF-α führt zum Abbau von Kollagen und induziert die extrazelluläre Matrix in der MI-Region, was zu einer Verdünnung der Ventrikelwand führt und die Wahrscheinlichkeit einer Herzruptur erhöht [51]; IL-6 kann zu einem Entzündungsfaktorsturm führen [52, 53]. Eine große Freisetzung von TNF-α und IL-6 im MI-Bereich verschlimmert die Myokardschädigung während eines akuten MI, verringert die Lebensfähigkeit des Myokards und führt zu ungünstigen ventrikulären Umbaupaaren (VR). In dieser Studie fanden wir erhöhte Werte von M1-Makrophagen-assoziierten proinflammatorischen Zytokinen (TNF-α und IL-6) und deren mRNA-Expression im Herzgewebe an den Tagen 7, 14 und 28 nach der MI-Operation, zusammen mit erhöhten mRNA-Werten der M1-Makrophagenmarker iNOS im Herzgewebe (Abb. 5, 6). Diese durch M1-Makrophagen induzierte Entzündung im ischämischen Herzgewebe steht im Einklang mit einer verminderten Überlebensrate, einer beeinträchtigten Herzfunktion und einer entzündlichen Zellinfiltration sowie pathologischen Schäden im Herzgewebe von Mäusen. Daher ist eine frühzeitige Regulierung der Sekretion von Entzündungsfaktoren zur Schaffung einer Mikroumgebung, die die ventrikuläre Reparatur begünstigt, äußerst wichtig, um Myokardinfarkt und den daraus resultierenden übermäßigen ventrikulären Umbau zu lindern.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Helmintheninfektionen und von Helminthen abgeleitete Proteine ​​das Immunsystem des Wirts immunmodulieren können, um verschiedene entzündliche Erkrankungen wie Arthritis [54], Kolitis [55,56,57], polymikrobielle Sepsis und durch Sepsis verursachte Schlüsselorganschäden zu lindern [31, 58], insbesondere Herzschäden [37]. In dieser Studie fanden wir heraus, dass die Behandlung mit Ts-AES bei Mäusen mit MI die Polarisierung von Mausmakrophagen vom M1- zum M2-Typ induzierte, was mit einer deutlich verringerten Entzündung im MI-Gewebe und einer verbesserten Reparatur und Umgestaltung des Herzgewebes einherging. Insbesondere Ts-AES hemmte die LPS + IFN-γ-induzierte M1-Polarisierung von BMDMs signifikant und förderte die M2-Makrophagenpolarisierung, was durch eine Abnahme des Prozentsatzes von Makrophagen vom Typ F4/80+CD11b+CD86+ und einen Anstieg des Prozentsatzes von F4/80 belegt wurde Makrophagen vom Typ +CD11b+CD206+ nach Ts-AES-Stimulation (Abb. 7). Wir fanden auch heraus, dass die Ts-AES-induzierte Polarisation von M2-Makrophagen in vitro die Apoptose hypoxischer Kardiomyozyten hemmen kann (Abb. 8). Es unterstützt die therapeutische Wirkung von Ts-AES bei Mäusen mit MI in vivo. Ähnliche Effekte von Ts-AES auf die Makrophagenpolarisierung vom M1- zum M2-Phänotyp wurden auch in vivo bei MI-Mäusen gefunden, gekennzeichnet durch verringerte Spiegel der M1-bezogenen Marker iNOS und der proinflammatorischen Zytokin-TNF-α- und IL-6-mRNA-Expression sowie erhöhte Spiegel der M2-bezogenen Marker CD206 und der regulatorischen Zytokin-IL-10-mRNA-Expression im Herzgewebe behandelter Mäuse (Abb. 6), obwohl bei mit Ts-AES behandelten Mäusen mit MI keine signifikante Änderung des TGF-β-Expressionsniveaus beobachtet wurde diese Studie. Diese Ergebnisse korrelierten mit der Verringerung pathologischer Schäden im Herzgewebe von Mäusen bei Myokardinfarkt, einer Verbesserung der Herzfunktion und einer Verringerung der Mortalität bei der Behandlung mit Ts-AES, was darauf hindeutet, dass die therapeutische Wirkung von Ts-AES auf Myokardinfarkt hauptsächlich mit Ts-AES zusammenhängt. förderte die Makrophagenpolarisierung vom M1-Phänotyp zum M2-Phänotyp im geschädigten Gewebe.

Nach einem Myokardinfarkt sammeln sich viele Makrophagen an der Stelle der Myokardschädigung an, darunter M2-Makrophagen, die Herzfibroblasten zu kollagensezernierenden Myofibroblasten aktivieren, indem sie Matrixmetalloproteinase (MMP) freisetzen [59] und TGF-β (dient als Hauptschalter), der den Übergang reguliert Entzündung bis hin zur Fibrose, die an Narbenbildung und Herzfibrose beteiligt sind [7, 60, 61]. In der Zwischenzeit setzen Myofibroblasten auf autokrine Weise die Zytokine TGF-β, Angiotensin II (Ang-II) und den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF) frei, was die Umwandlung von Herzfibroblasten in Myofibroblasten, die α-SMA in großen Mengen exprimieren, weiter stimuliert, um sie weiter zu fördern Myokardfibrose zur Verhinderung einer Herzruptur [62,63,64]. Eine übermäßige Aktivierung von Herzfibroblasten kann jedoch zur Narbenproliferation führen, die systolische und diastolische Funktion des Herzens verringern und eine Herzinsuffizienz auslösen [14]. Daher ist es wichtig, M2-Makrophagen zu induzieren, die bei spätem Myokardinfarkt eine antifibrotische Aktivität ausüben, um eine übermäßige Aktivierung von Herzfibroblasten zu hemmen, die Bildung von Narbengewebe zu reduzieren und nachteilige VR zu vermeiden [65]. In dieser Studie fanden wir heraus, dass es am Tag 7 nach dem MI keine signifikante Veränderung der α-SMA-mRNA-Expression im MI-Bereich von Mäusen gab, die mit Ts-AES behandelt wurden, wohingegen die mRNA-Expression von α-SMA an den Tagen 14 und 20 signifikant verringert war 28 nach MI, was mit der verringerten Herzfibrose übereinstimmt, die bei mit Ts-AES behandelten MI-Mäusen beobachtet wurde (Abb. 4). Die verringerte Fibrose im MI-Bereich wurde auch durch die verringerten TGF-β-Expressionsniveaus im Serum und Herzgewebe nach der Behandlung mit Ts-AES gestützt (Abb. 5, 6). Gleichzeitig setzen M2-Makrophagen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) frei [66], der die Neovaskularisierung fördert, Gewebeischämie und Hypoxie lindert, Myokardschäden reduziert und die ventrikuläre Reparatur beschleunigt [67, 68]. In dieser Studie war das Expressionsniveau von VEGF im Myokardinfarktbereich bei mit Ts-AES behandelten MI-Mäusen signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass Ts-AES die Neovaskularisation im Myokardinfarktbereich von Mäusen mit MI fördert. Von M2-Makrophagen sezerniertes IL-10 ist ein starkes entzündungshemmendes Zytokin mit der Fähigkeit, die Synthese von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in Makrophagen durch Aktivierung des STAT3-Signals zu unterdrücken [69] und verbessert die kardiale Umgestaltung nach einem Myokardinfarkt durch Stimulierung der M2-Makrophagenpolarisation und Fibroblastenaktivierung [70, 71]. In der vorliegenden Studie waren die IL-10-Spiegel bei Ts-AES-behandelten MI-Mäusen signifikant erhöht und erreichten den höchsten Wert am Tag 14 nach dem MI, was darauf hindeutet, dass IL-10 hauptsächlich an der Regulation im mittleren Stadium des MI beteiligt ist MI.

In unserer vorherigen Studie haben wir gezeigt, dass beide ES-Produkte aus erwachsenen T. spiralis-Würmern (AES) oder Muskellarven (MES) therapeutische Wirkungen auf Sepsis-induzierte Herzschäden [37] oder akute Lungenschäden [31] haben, was darauf hindeutet, dass einige Komponenten Bei Erwachsenen oder Larven spielen ES-Produkte eine immunmodulatorische Rolle bei der Immunantwort des Wirts, um Entzündungsreaktionen zu reduzieren. Sowohl AES als auch MES reduzierten proinflammatorische Zytokine (TNF-α, IL-6) und induzierten regulatorische Zytokine (IL-10 und TGF-β). Die Rolle von MES könnte in der Hemmung des Entzündungssignalwegs HMGB1/TLR2/MyD88 bestehen [37]. In dieser Studie haben wir zum ersten Mal die therapeutische Wirkung von Ts-AES auf MI durch Modulation der Makrophagenpolarisation von M1 nach M2 nachgewiesen. Die unterschiedlichen Wirkungen von AES und MES weisen darauf hin, dass T. spiralis ES-Produkte eine Vielzahl von Proteinen enthalten, die unterschiedliche biologische und immunologische Funktionen haben können. Es ist wichtig, diese immunmodulatorischen Proteine ​​in AES und MES zu identifizieren und sie als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie MI-induzierten Entzündungen zu entwickeln. Die aus Würmern gewonnenen Rohstoffe sind aufgrund ihres Sicherheitsrisikos und der Schwierigkeiten bei der Massenproduktion der Produkte nicht als pharmazeutische Reagenzien geeignet [48, 72]. Daher ist es notwendig, spezifische Moleküle im Ts-ES-Komplex zu identifizieren, die an der Immunmodulation beteiligt sind. Aktuelle Studien haben verschiedene Proteinkomponenten in Ts-AES mit potenziellen regulatorischen Funktionen identifiziert, z. B. Serinprotease aus dem adulten Stadium von T. spiralis lindert die Schwere der TNBS-induzierten Kolitis durch Ausgleich der CD4+-T-Zell-Immunantwort [73]; rekombinantes T. spiralis-Cystatin lindert die polymikrobielle Sepsis durch die Aktivierung regulatorischer Makrophagen [58]. Auch der entzündliche Signalweg, über den Ts-AES die Makrophagenpolarisierung reguliert, um MI zu verbessern, ist immer noch unklar. Unser nächster Schritt besteht darin, spezifische und wirksame Komponenten im Ts-AES zu identifizieren, die die Makrophagenpolarisierung regulieren und eine therapeutische Wirkung bei MI oder anderen entzündlichen Erkrankungen ausüben.

Ts-AES verbesserte die Herzfunktion und den ventrikulären Umbau bei Mäusen mit Myokardinfarkt, indem es die regulatorische Makrophagenpolarisierung (M2) induzierte. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass aus Würmern stammende Proteine ​​als pharmazeutische Wirkstoffe zur Behandlung von Myokardschäden oder anderen entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden können.

Alle in dieser Studie vorgestellten Datensätze sind im Artikel/Ergänzungsmaterial enthalten.

Herzinfarkt

Ventrikulärer Umbau

Schlagvolumen

Linksventrikuläre Ejektionsfraktion

Fraktionierte Verkürzung des linken Ventrikels

Endsystolisches Volumen des linken Ventrikels

Enddiastolisches Volumen des linken Ventrikels

Leistungsindex des linksventrikulären Myokards

Enzymimmunoassay

Interleukin 6

Tumornekrosefaktor-Alpha

Transformierender Wachstumsfaktor-β1

Interleukin 10

Alpha-Glattmuskel-Aktin

Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Induzierbare Stickoxid-Synthase

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Unzutreffend.

Dieses Projekt wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Anhui (Nr. 2008085MH260) unterstützt; 512 Talententwicklungsprojekt des Bengbu Medical College (Nr. by51201205, by51201306); die Natural Science Foundation des Bengbu Medical College (Nr. 2020bypd007); das Postgraduate Scientific Research Innovation Program der Anhui Higher Education Institutions (Nr. 2022xscx124) und das Key Research Platform Open Project der Provinz Anhui (Nr. KLICD-2022-Z1).

Lingqin Wu, Wenhui Yin und Jutai Wen haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity des Bengbu Medical College, Bengbu, 233000, China

Lingqin Wu, Wenhui Yin, Jutai Wen, Shuying Wang, Huihui Li, Xiaoli Wang, Weixiao Zhang, Shuyao Duan, Qiuyu Zhu und Xiaodi Yang

Erstes angegliedertes Krankenhaus des Bengbu Medical College, Bengbu, 233000, China

Lingqin Wu, Wenhui Yin, Shuying Wang, Weixiao Zhang, Shili Wu und Rui Zhou

Zweites angegliedertes Krankenhaus der Jiaxing-Universität, Jiaxing, 314000, China

Lingqin Wu

Basic Medical College des Bengbu Medical College, Bengbu, 233000, China

Huihui Li, Xiaoli Wang und Xiaodi Yang

Lewis Katz School of Medicine, Temple University, Philadelphia, PA, 19140, USA

Erhe Gao

National School of Tropical Medicine, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Bin Zhan

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XDY, RZ und LQW konzipierten und gestalteten die Studie; LQW, WHY, JTW, SYW, SYD, QYZ, EHG führten die Experimente durch; HHL, XLW, WXZ analysierten die Daten; LQW, WARUM das Manuskript geschrieben wurde. BZ, SLW, XDY und RZ haben das Manuskript kritisch überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Rui Zhou oder Xiaodi Yang.

Die Tierstudie wurde vom Animal Care and Use Committee des Bengbu Medical College überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer BBMC-2019-102).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, L., Yin, W., Wen, J. et al. Ausscheidungs-/Sekretionsprodukte von erwachsenen Würmern des Typs Trichinella spiralis lindern Myokardinfarkte, indem sie in einem Mausmodell eine M2-Makrophagenpolarisation induzieren. Parasites Vectors 16, 362 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05930-x

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Eingegangen: 26. Mai 2023

Angenommen: 14. August 2023

Veröffentlicht: 16. Oktober 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05930-x

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